常温运输的【悬浮生长细胞】制备操作说明

作者:CytoBiotech



常温运输的【悬浮生长细胞】制备操作说明‍

本操作适用于悬浮生长的细胞

第一、悬浮生长细胞共同特性:

生长方式: 悬浮生长

培养方式:垂直放置CO2培养箱(5%CO2+37°+95%湿度),通气培养(无菌)

运输条件:常温运输
细胞生长习性

X细胞(例如K562、NK-92、THP-1等)悬浮生长,不能直接换液。可通过补液后垂直培养实现营养补充。若需要换液,先2000转离心5分钟,弃掉上清再用完全培养基重悬。但这样换液相当于传代一次,对细胞生长增殖有影响。

X细胞(例如K562、NK-92、THP-1等)12h或24h左右倍增一代。生长代谢正常的细胞培养基隔夜就会变黄,需要每天补液(不需要换液)一次。每次补液量,为上次总体积的1.5倍。

补液总体积不宜超过70ml,以确保细胞良好状态和“安全”生长。


常规培养条件:90% RPMI-1640+10%FBS+1X双抗+5%CO2+37°+O2+95%湿度
A、RPMI-1640(含谷氨酰胺),Corning#10-040-CVR;

B、FBS(胎牛血清):BI#04-001-1ACS;

C、双抗:HyClone#SV30010,使用浓度1X


第二、15ml离心管常温运输的【悬浮生长细胞】制备操作说明:


悬浮细胞常温运输细胞到货操作说明总操作原则 :收到细胞后,离心管表面消毒,超净台或生物安全柜内直接均分接种到2个 T25透气瓶。其中一瓶补完全培养基5ml,垂直培养48h;另外一瓶水平培养,第二天补5ml完全培养基,培养48h。具体操作如下:

1、实验准备:预热完全培养基6ml,预先标记透气T25瓶2个,无菌的剪刀,1ml枪头及移液器等耗材。

2、消毒:超净台或生物安全柜内,将运输悬浮细胞单悬液的离心管表明酒精棉球擦拭消毒,去掉封口膜,再次酒精棉球擦拭消毒。

3、分瓶与接种:

a、预先将T25透气瓶A,添加5ml的完全培养基 (1640或H-DMEM),盖上盖。

b、1ml移液器插上1ml无菌枪头。取无菌的剪刀,剪掉1ml枪头尖约2cm。

c、使用去掉枪头尖的移液器,吸取7.5ml(约离心管总体积的1/2)单悬液(此步骤,也可将15ml离心管口过火后,直接导入培养瓶,但需要确保无菌操作),沿着瓶壁接种到T25透气瓶A内。不吹打,也不晃动,垂直放置CO2培养箱透气培养48h。

d、剩余的单悬液,按照c方法接种到透气T25透气瓶B中,水平放置CO2培养箱透气培养24h后补完全培养基5ml。

4、观察或补液:

a、垂直培养的T25透气瓶A,水平放置显微镜先观察细胞是否成串或团状,培养基是否变黄,并4X、10X和20X拍照。拍照完,立即垂直放置培养箱继续培养24h后补完全培养基5ml。

b、水平培养的T25透气瓶AB,水平放置显微镜先观察细胞是否成串或团状,培养基是否变黄,并4X、10X和20X拍照。拍照完,超净台或生物安全柜内补液预热过的完全培养基5ml,水平放置培养箱继续培养24h。止到T25瓶总体积大于10ml以后,将T25透气瓶AB垂直放置培养。

5、换液或离心条件:20-25°(室温)2000转,5min,

6、注意事项:悬浮细胞 ,切忌直接换液(细胞会大量丢失),切忌频繁离心换液。采取补液方式,更有利于高密度细胞的扩增和高活力细胞的富集。

7、若有问题,请对新更换培养瓶外观拍照和细胞形态显微拍照备案,并邮件CytoBio@qq.com


第三、细胞冻存条件:


RPMI-1640(或H-DMEM):FBS:DMSO(Sigma#D2650-100ML)=7:2:1,或者:10% DMSO(Sigma#D2650-100ML)+90% FBS(优质胎牛血清,不需要添加培养基或者其他组份)。冻存细胞请遵守“慢冻存、快复苏”的原则。

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