灌满液运输和3D运输【贴壁生长细胞】制备操作说明

作者:Cytobiotech


灌满液运输和3D运输【贴壁生长细胞】制备操作说明

本操作适用于贴壁生长的细胞

第一、灌满液运输【贴壁生长细胞】制备说明:

1【消毒观察】收到细胞,T25瓶表面75%酒精消毒后,显微镜下4X10X20X观察(是否有细胞脱落或碎片,是否有污染、形态是否完整)

2【细胞恢复】去掉封口膜,酒精棉球擦拭瓶颈和瓶盖,垂直放置37°CO2培养箱松一圈瓶盖,培养(恢复30分钟

3【观察细胞】再次显微镜4X10X20X观察细胞形态和细胞融合度(汇合度)。

4【收集培养基】超净台内倒出T25瓶内所有培养基,收集于2*50ml离心管(若细胞碎片或脱落较少,不离心)2000转离心5分钟取上清补加5% FBS(可添加1X双抗)4度保存,后续细胞培养继续使用。

5【细胞清洗】确保细胞汇合度大于90%以上可传代或冻抱团生长细胞汇合度达到50%),例如Hep G2细胞LNCaP细胞)。T25瓶内,添加4ml预热的PBS,左右方向轻轻晃动2次清洗细胞,弃掉上清。再次,按此方法清洗细胞1遍(共清洗2遍)

6【细胞消化】向T25瓶内缓慢添加1ml EDTA的胰酶(0.25%),左右方向轻轻晃动2次,胰酶均匀分布于T25瓶内底部水平放置CO2培养箱(37°)消化30(具体消化时间以胰酶和细胞自身特点而定,可参考细胞识别特征编码。取出T25瓶显微镜下(水平放置)观察细胞形态变化,细胞变圆或形态明显收缩后终止消化。

7【消化终止】超净台内,T25瓶内添加3ml完全培养基终止消化。

8【细胞单悬液制备】使用1ml移液器,缓慢吹打约10-15次,成单细胞悬液。均分移液到25ml离心管或215ml离心管(1/2冻存,1/22*T25瓶),1200转离心5分钟 。

9【细胞冻存和传代】超净台内,弃掉上清。1/2冻存,1/22*T25瓶(5ml体系 /T25瓶)。

10注意事项
a、第五步的【细胞清洗】时,若有细胞脱落,收集洗液,1200转离心5分钟,细胞沉淀重悬接种T25瓶内培养。

b传代后的贴壁细胞水平放置培养基内培养。


第二、3D运输【贴壁生长细胞】制备说明:


A、注意事项:
a3D运输包装的可立离心管或冻存管或EP管不防爆,不耐低温;管内不含DMSO,请勿直接放入-80度冰箱或者液氮冻存。请务必按照下面操作指南接种细胞。

b、本操作传瓶数目和体积,主要细胞总数目介于5*10e51*10e6细胞数/管之间的,若细胞数目大于10e7/管,可使用10cm的细胞培养皿接种。操作方法相同,培养体系总体积不同。


B操作说明

1【表面消毒】收到细胞后,用75%的酒精喷外包装和冻存管(或离心管或EP)的外部(消毒),并冻存管(或离心管或EP)垂直放置超净工作台通风2分钟。酒精棉球擦拭冻存管(EP)外周后,拆掉封口膜后,更换酒精棉球再次擦拭管口。

2【材料准备】准备2T25培养瓶(透气盖),分别标记为T25AT25B预热的10ml-15ml完全培养基(H-DMEM

3【细胞接种】止血钳(或镊子)打开管盖,按照下面操作步骤重悬接种细胞:
细胞接种密度要求:1管传2T25瓶(贴壁过夜后融合度大于35%,小于50%
a【单悬液制备和接种】1ml的移液器将冻存管(EP)内细胞运输液(约1.8ml+)轻轻吹打10次,目测无明显细胞沉淀或细胞颗粒或细胞团。从冻存管内,吸取1ml单细胞悬液,接种到预先盛5ml 完全培养基(H-DMEM)的T25A;吸取800ul单细胞悬液,接种到预先盛5ml 完全培养基(H-DMEM)的T25B中。T25B中吸取1ml单悬液,轻柔吹打清洗冻存管内2遍,并收集每次的洗液至T25B内。
b【细胞观察】拧紧T25瓶盖(透气盖),丢弃细胞运输冻存管(EP管),酒精棉球擦拭超净台面。

显微镜下4X10X20X观察、拍照和记录。若还有大量细胞团,用1ml移液器缓慢吹打细胞5-10

c【细胞培养】将T25水平放置于含5% CO295%湿度的37CO2培养箱内,正常培养。

d【细胞观察和换液】细胞接种24h后,显微镜下观察,并换液。即:缓慢移动培养瓶,超净台内倒掉培养瓶内的废液,T25瓶内缓慢添加预热的5ml完全培养基(请勿PBS清洗或直接吹打细胞!)。

e【细胞观察】细胞接种48h后,显微镜下观察。细胞融合度低于80%的,换液;细胞融合度大于80%的,传代或冻存

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